La Transformación de una Planta Transgénica

El insertar un gen en una planta para que esta se encargue de producir una proteína que regularmente no produce, se puede lograr por una variedad de métodos. Estos métodos de transferencia se dividen en dos grupos: los métodos biológicos y los métodos directos. En los métodos biológicos, como transformación mediada por Agrobacterium y transducción viral, se emplea un vector vivo que lleva el material genético a la célula. Entre los métodos directos mas empleados se encuentran el bombardeo por una partícula (“biolistics”), transformación del cloroplasto, técnica “Galistan” (inyección), ingeniería metabólica y cultivo de células en plantas. Estos son los métodos más eficientes y seguros para poder llevar el proceso a su cabalidad.
La técnica de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens sentó las bases para la creación de las plantas transgénicas y la amplia variedad de aplicaciones que esta tecnología provee. En forma general, consiste del intercambio genético por medio de callos que le causa a la planta. Es el método que más se utiliza. (Ver artículo anterior para más detalle).
El método de infiltración de Agrobacterium al vacío o vacuum, es uno relativamente nuevo y sencillo, utilizado para la transformación de Arabidopsis thaliana. Esta técnica, conocida como "Floral Dipping", simplifica el método tradicional de la transformación mediada por Agrobacterium. Los pasos para ello son:
1. Cultivación de Arabidopsis hasta que florezca.
2. Remoción o "uprooting" de la planta.
3. Aplicación de Agrobacterium a través de una infiltración al vacío en un medio de sacaroa/hormonas.
4. Replantación de la planta.
5. Colección de las semillas después de unas semanas de cultivo.
6. Identificación de la progenie deseada al crecer selectivamente en un medio de antibióticos o hierbicidas.
Con este método se minimiza la variación somaclonal asociada con el cultivo y la regeneración de tejidos ya que la mayoría de la progenie transformada es genéticamente uniforme (no-quimérica).
El otro método biológico es por medio de la transducción viral, la transferencia del ADN viral de una célula a otra por un bacteriófago. La ventaja de este método es que al ser el genoma manipulado transferido por un bacteriófago a otra célula huésped, este quedará inscrito en el modo de replicación de ADN de la célula infectada y, por lo tanto, producirá numerosas copias de ADN recombinante aumentando la expresión de una proteína en corto tiempo.
Entre los métodos de transferencia directa la más utilizada es el bombardeo por una partícula o “Biolistics”. Esta técnica envuelve el uso de una partícula (usualmente de metal) cubierta de una capa de ácido nucleótido la cual es proyectada a una célula o tejido dirigido a grandes velocidades. Se utiliza una pistola de helio, conocida como “Gene Gun”, para poder proyectar estas partículas. El ADN alrededor de la partícula ya dentro de la célula se desprende y una porción se incorporará a los cromosomas del huésped. En un experimento de este tipo normalmente se generan 8,000 “disparos” por plato bombardeado. Es considerado como la forma más estable de inserción de gen en el genoma nuclear de la planta, además de la técnica de Agrobacterium. Pero, algunas desventajas son que provee un amplio margen de resultados impredecibles e incrementa la tasa de mutación celular.

La inserción de genoma foráneo por medio del genoma separado del cloroplasto se puede hacer por tres métodos: “biolistics”, transformación mediada por glicol de polietileno (PEG) y por expansión “Galistan” por una femto-aguja.
La transformación mediada por PEG requiere la preparación del protoplasto (la célula vegetal sin la pared). Los protoplastos se fusionan mediante el PEG, se obtienen híbridos y, por recombinación, células transgénicas. Para esto, también requiere que la proteína al producirse sea regenerable por el mismo. Su principio envuelve que el cloroplasto adquiere ADN en presencia de PEG por cambios en la membrana plasmática, de forma que este entra al citoplasma y es transportado al cloroplasto donde es añadido como parte integral de su genoma original. Luego, como el cloroplasto es parte esencial del proceso fotosintético, todas las plantas tienen múltiples copias de ellos, factor que ayuda en altos niveles de expresión.
La técnica “Galistan” es la más novedosa y por lo tanto, la menos practicada. Esta trata de la microinyección de ADN al cloroplasto utilizando la expansión de un líquido dentro de la aguja inducido por el calor (“Galistan”) que obliga la transformación del plásmido de ADN dirigido. También se utiliza la técnica de inyección, a nivel macro y micro, para insertar el material genético foráneo directamente al núcleo de la célula. Este método presenta menos errores aleatorios por su eficacia.
La ingeniería metabólica trata sobre la modificación de procesos metabólicos de las células enfocados en cambiar genes estructurales y genes regulatorios, como los genes que codifican para los promotores. Al modificar un promotor se puede controlar no tan solo la cantidad de proteína sintetizada, sino que se puede controlar la acumulación de esta proteína en áreas específicas en la célula de la planta.
Finalmente, el último método utilizado es la producción de proteínas por el cultivo de células. En estos proyectos, usualmente, insertan el ADN en la célula de la planta y la crecen en un cultivo dentro de un caldo nutricional. De esta forma, las células producen rápidamente la proteína y ésta es desechada al medio, donde su extracción es más sencilla. Sin embargo, por el comportamiento de ciertas proteínas en medio líquido, hay veces que se requiere un equipo sofisticado para una extracción efectiva, como un bioreactor que separa las proteínas por cromatografía de afinidad después de que estas hayan sido sintetizadas (“Affinity-Chromatography Bioreactor” o ACBR).

Referencias:

Genetic Engineering of Plant Signal Transduction Mechanisms. Xing T, Jordan M. Cereal Research Centre, Agriculture and Agri-Food. Winnipeg, Canada. Disponible en http://pubs.nrc-nrc.gc.ca/ispmb/ispmb18/R00-047.pdf

Plant Cell Cultures for the Production of Recombinant Proteins. Hellwig, Drossard, Twyman & Fischer, Nature Biotechnology. 2004. Disponible en www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nbt/.../n11/full/nbt1027.html

Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Clough SJ, Bent AF. The Plant Journal. Disponible en http://www.blackwell synergy.com/links/doi/10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x/full/?cookieSet=1.

Transgénicos en la Agricultura. Francisco Fontúrbel Rada, Revista de Biología y Ciencias de la Salud. Disponible en http://www.biologia.org/?pid=5000&id=69&page=0

Foto= Gene Gun. Wikipedia, the Free Encyclopedia. Disponible en http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Genegun.jpg

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